Diferentes versiones del gel MYB10 son responsables de la variación natural en el color rojo de las fresas
El color del fruto es uno de los primeros atributos que atraen al consumidor. Este carácter depende de la acumulación durante la maduración de pigmentos que pertenecen fundamentalmente a dos grupos químicos: las antocianinas (rojo, púrpura, azul, violeta) y los carotenoides (rojo, anaranjado, amarillo).
Por Cristina Castillejo e Iraida Amaya. Área de Genómica y Biotecnología del Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA). Centro IFAPA de Málaga.
Estos pigmentos, además de aumentar el atractivo de los frutos, poseen una gran capacidad antioxidante, lo que supone un valor añadido por sus efectos beneficiosos para la salud. Las fresas maduras de las diferentes especies del género Fragaria se presentan en un abanico de colores que va desde el burdeos al blanco, pasando por todos los tonos intermedios (Figura 1A). Las fresas también difieren en la distribución del color por el interior del fruto (Figura 1B). Las hay totalmente blancas, con pigmentos sólo en el exterior (epidermis) o coloreadas también en el interior (pulpa). Esta diversidad de colores y patrones se debe a diferentes niveles de antocianinas. En la especie comercial (Fragaria ´ananassa), la mayor parte de la variabilidad natural, reflejo de la diversidad genética de las especies, se perdió con la domesticación, pues solo unas pocas de ellas son elegidas para ser cultivadas, y posterior mejora genética. Pero a su vez, mutantes espontáneos que quizás no hubieran sobrevivido en condiciones silvestres han sido seleccionados en las variedades domesticadas. La preferencia en el caso de la fresa se ha dirigido hacia frutos uniformemente coloreados de rojo intenso tanto en el exterior como el interior.
Determinar visualmente las diferencias entre una especie cultivada y su relativo silvestre suele ser tarea fácil. A nivel genético, identificar la(s) diferencia(s) que dan lugar a un rasgo particular es mucho más complejo ya que se encuentran acompañadas de otras muchas mutaciones no relacionadas con el carácter de interés. El mapeo por QTL (del inglés Quantitative Trait Loci) es un método estadístico que se aplica para establecer asociaciones entre un rasgo fenotípico determinado (el fenotipo es cualquier característica o rasgo observable de un organismo; por ejemplo, el color externo o interno del fruto) y una región concreta del genoma (delimitada por marcadores de ADN). Los análisis de QTLs nos permiten conocer si un carácter está controlado por una batería de genes con poco efecto cada uno o, por el contrario, están implicados pocos genes que tienen un gran peso en el carácter.
Nuestro grupo de investigación en el laboratorio de Genómica y Biotecnología de Fresa del centro IFAPA de Málaga lleva varios años investigando los componentes genéticos que controlan la variación en caracteres relacionados con la calidad de los frutos. Recientemente hemos realizado un análisis de QTLs enmarcado en el proyecto interno del IFAPA PP.AVA2019.034 y en el proyecto PID2019-111496RR-I00, financiado por la Agencia Estatal de Investigación, para identificar regiones genómicas asociadas al color rojo del interior del fruto. Para ello hemos utilizando una población de 105 líneas de fresa, todas con frutos rojos en el exterior, que diferían en la gradación de color en el interior (Figura 1B). El QTL identificado explica un alto porcentaje de esta variación (68.2-68.5%) y se corresponde con una región genómica que contiene 171 genes, entre los que se encontraba el gen MYB10. MYB10 es el factor responsable de la activación de la maquinaria de biosíntesis de antocianinas y, como tal, un fuerte candidato a ser el responsable de la variación de color en la fresa. Posteriormente identificamos que, en efecto, existe una variante de este gen presente únicamente en los frutos totalmente rojos. El cambio consistía en una inserción de gran tamaño en la secuencia de MYB10 que parece proporcionarle la capacidad de activarse en el interior del fruto además de en el exterior. La secuencia extra pertenece a un transposón de ADN, elementos móviles que tienen la capacidad de saltar y aterrizar en diferentes ubicaciones dentro del genoma. Como nos ilustra el rojo del interior del fruto de fresa, la variabilidad genética generada por los transposones puede traducirse en una característica nueva para el organismo. Curiosamente, eventos similares han ocurrido en numerosas especies de forma independiente. Que una uva sea tinta o blanca depende de otro transposón en el gen MYB10 de uva, por ejemplo.
Figura 1. Ejemplos de la variación del color externo (A) e interno (B) del fruto de fresa. Los ejemplos en el panel B incluyen el parental femenino de la población utilizada en nuestro estudio (‘Senga Sengana’) y diferentes líneas de la progenie (Líneas CS). El parental masculino presenta un fenotipo 1 igual a CS-79 (pulpa completamente blanca y epidermis roja).
La gran mayoría de los ancestros silvestres de la fresa cultivada tienen frutos con interior blanco y no presentan el transposón en MYB10, sugiriendo que el color rojo del interior es un carácter que muy probablemente fue seleccionado de forma artificial en el proceso de domesticación. Una excepción es la fresa chilena, Fragaria chiloensis, donde además de frutos rojos, los indios mapuches, responsables de su domesticación seleccionaron también variedades con frutos completamente blancos.
Además de en la población que utilizamos para identificar el QTL, hemos analizado el gen MYB10 de otras variedades y especies de Fragaria con orígenes geográficos diversos, esta vez con frutos completamente blancos tanto en el interior como en el exterior. Sorprendentemente, todas ellas son portadoras de diferentes mutaciones que conllevan la inactivación de MYB10. Si MYB10 no puede ejercer su función, no se induce la síntesis de antocianinas y los frutos, a pesar de madurar correctamente, no acumulan pigmentos.
Además, hemos comprobado que los frutos blancos presentan niveles similares de azucares totales, vitamina C y de otros antioxidantes a excepción de las antocianinas, no encontrando diferencias significativas en la capacidad antioxidante de estos frutos. Los resultados de esta investigación han sido publicados en diciembre de 2020 en la prestigiosa revista científica The Plant Cell (Castillejo et al., 2020). Toda esta información molecular, además de recordarnos que la ‘modificación genética’ no solo ocurre en el laboratorio, sino también en el proceso de seleccionar unas variedades en detrimento de otras, nos permite desarrollar potentes herramientas para la mejora de los cultivos: los marcadores moleculares.
La mejora tradicional incluye la selección de parentales que puedan proporcionar atributos complementarios a la descendencia derivada del cruzamiento. Este proceso se puede ver acelerado y beneficiado enormemente si se acompaña del uso test genéticos (marcadores moleculares) que permiten predecir con una probabilidad muy alta la presencia o no del rasgo fenotípico de interés, tanto en los parentales como en la descendencia, sin necesidad de crecerlos hasta estadios avanzados en los que sea posible observar el fenotipo.
La selección asistida por marcadores (MAS) puede resultar clave en el desarrollo de nuevas variedades comerciales a partir de los parientes silvestres de las especies cultivadas. Estos parientes silvestres contienen una diversidad genética, y por tanto de caracteres, mucho mayor que los descendientes domesticados. En esta reserva se encuentran muchos atributos que cobran importancia en el contexto actual de cambio climático, tales como la resistencia a plagas y patógenos, tolerancia a salinidad y sequía y, en general, a condiciones de crecimiento más diversas que las de las especies cultivadas. Sin embargo, recurrir a los parientes silvestres tiene el riesgo asociado de perder caracteres minuciosamente seleccionados durante la domesticación y mejora de los cultivos. Los marcadores moleculares nos proporcionan la posibilidad de seguir y seleccionar en la descendencia de los cruzamientos tanto los nuevos caracteres a introgresar como aquellos que se quieran mantener o eliminar, aumentando considerablemente la eficiencia del proceso de selección de nuevas variedades.
DESARROLLO DE MARCADORES PREDICTIVOS DEL COLOR DEL FRUTO DE FRESA
El conocimiento de las variantes genéticas en el gen MYB10 que determinan tanto la presencia o no de antocianinas en el fruto, o de aquellas responsables de que el color se extienda hacia el interior, nos ha permitido el desarrollo de dos marcadores moleculares para predecir genéticamente ambos fenotipos (Castillejo et al., 2020). Los dos marcadores utilizan técnicas basadas en la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) y tienen la propiedad de ser aplicados a gran escala de forma sencilla, rápida y económica. Además, al haber sido diseñados directamente sobre el gen causante del fenotipo, su capacidad predictiva es prácticamente del 100%.
El test para predecir el color en el interior del fruto es un marcador de tipo KASP (Kompetitive Allele Specific PCR). Se basa en la detección de una variación en el ADN ligada a la presencia del transposón en MYB10 y resultó tener una fiabilidad del 99%. El resultado del análisis genético es un gráfico fácilmente interpretable como el de la Figura 2, en el cual cada una de las líneas o variedades analizadas se clasifica dentro de un cluster o grupo según su genotipo: Homocigoto con el transposón (interior rojo), homocigoto sin transposón (interior blanco) y heterocigotos (interior rojo intermedio; puntuación 2 en la Figura 1B).
El test para predecir la ausencia total de antocianinas en el fruto de fresa se basa en la técnica HRM (High Resolution Melting). Ha sido diseñado para detectar una deleción de 8 pb en la zona codificante de MYB10, detectada en parientes silvestres de la fresa cultivada (F. chiloensis) y que da lugar a una proteína no funcional. En este análisis, los grupos genotípicos se diferencian en las curvas de desnaturalización tras la PCR (Figura 2B).
Figura 2. Marcadores predictivos para el color del fruto de fresa. (A) Grafica de dispersión del marcador KASP IFC-2 revelando los grupos de variedades de fresa con pulpa blanca en el eje X (FAM; puntos amarillos), variedades homocigotas con pulpa roja en el eje Y (HEX; cuadrados azules), y líneas heterocigotas en el medio (triángulos verdes). (B) Análisis del marcador HRM WS_CID_01 para predecir el color blanco en fruto de fresa. Picos azules y rojos asociados con color blanco y rojo del fruto, respectivamente. Adaptado de Castillejo et al 2020. The Plant Cell 32, 3723–3749.
REFERENCIAS
Castillejo et al. (2020). Allelic Variation of MYB10 Is the Major Force Controlling Natural Variation in Skin and Flesh Color in Strawberry (Fragaria spp.) Fruit. Plant Cell.
