FanCXE1, una nueva pieza en la producción de los aromas de la fresa

Estudio de investigación sobre el gen FanCXE1 llevado a cambo por los investigadores de Félix Juan Martínez-Rivas, Rosario Blanco-Portales, Enriqueta Moyano, José Luis Caballero, Juan Muñoz-Blanco y Francisco Javier Molina-Hidalgo, del Grupo BIO-278 “Biotecnología y Farmacognosia Vegetal”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba. Spain. ¹bb1mublj@uco.es; ²b52mohif@uco.es.

La fresa (Fragaria × ananassa) es una de las frutas más consumidas a nivel mundial y forma parte de la dieta de millones de personas. Su cultivo se extiende por diversas regiones del mundo, desde los polos hasta los trópicos, aunque concentrado mayoritariamente en el hemisferio norte. De hecho, no existen barreras genéticas ni climáticas al cultivo. Por todo esto, la investigación en la mejora biotecnológica del cultivo de fresa es un campo muy activo en la actualidad, aunque su aplicación es muy limitada debido al coste económico de los programas de desarrollo. En las dos últimas décadas se han identificado varios genes implicados en procesos importantes relacionados con la producción y la calidad del fruto. No obstante, la evaluación de la función de dichos genes es un proceso bastante lento debido al tiempo necesario para la generación de plantas transgénicas que, aunque son una herramienta muy valiosa para la selección de genes que puedan determinar una mejora cualitativa de los frutos, ralentiza todo el proceso de investigación.

El estudio de la mejora de las propiedades organolépticas del fruto ha ido ganando importancia en diferentes investigaciones en función de las demandas del consumidor. El sabor de la fresa es una de sus principales características y hacen de ella una de las frutas más deseadas por los consumidores. El dulzor de este fruto, como consecuencia de su alta concentración de azúcares, juega un papel importante en la determinación de su sabor y calidad. Además, dicha concentración de azúcares afecta de forma determinante al potencial osmótico de las células, lo que puede generar un desajuste en la importación de agua y, por lo tanto, puede afectar al crecimiento y turgor del fruto.

El color de la fresa viene determinado principalmente por la presencia de antocianinas y flavonoides cuya síntesis se desarrolla en dos etapas: en la etapa de desarrollo del fruto y en la etapa de su maduración. En los primeros estadios del desarrollo, se acumulan fundamentalmente proantocianidinas, compuestos asociados a la defensa del fruto frente a patógenos y herbívoros. Una vez alcanzada la etapa de maduración, los receptáculos maduros acumulan principalmente antocianinas, que son las responsables del color rojo característico del fruto de fresa, y cuya función fundamental es atraer a los herbívoros para dispersar las semillas.

La intensidad del sabor del fruto de fresa depende en gran medida de la percepción olfatoria retronasal de los compuestos volátiles que contiene. Estos contribuyen en la intensidad y percepción sensorial de la acidez y dulzura del fruto a pesar de suponer tan solo un 0,001-0,01% del peso fresco de éste. Más de 360 compuestos volátiles han sido identificados en el fruto de fresa, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, furanos, terpenos, aldehídos y compuestos sulfurados (Schwieterman et al., 2014). El tipo y la concentración de los volátiles depende, en gran medida, del grado de maduración y del cultivar analizado.

El aroma del fruto es una mezcla compleja de diferentes compuestos (Tabla 1). El recuerdo afrutado lo otorgan diferentes ésteres, como el etil-butanoato, hexil-butanoato y el metil 2-metilbutanoato, el olor a “verde” producido por Z-3-hexenal, dulce por ácido butanoico y 2-metilbutanoico, melocotón por decalacatona y caramelo por [4-hydroxy-2,5-dimetil-3(2H)-furanona (HDMF, furaneol)], y 2,5-dietil-4-metoxy-3(2H)-furanona (DMMF)) (Pyysalo et al., 1979, Larsen et al., 1992). De estos, destaca el HDMF, ya que aumenta su concentración a lo largo de la maduración, con concentraciones más altas en los frutos muy maduros, aunque es rápidamente metalizado a su derivado HDMF-glucósido (Pérez et al., 1996; Roscher et al., 1998). El elevado número de compuestos relacionados con el aroma en el fruto de fresa sugiere que las enzimas involucradas podrían ser multifuncionales, lo que evitaría un gasto extra de energía en la síntesis de proteínas nuevas. No obstante, esto también podría ser un reflejo de la falta de especificidad de enzimas como reductasas, esterasas, oxidasas, etc., implicadas en la producción de numerosos compuestos involucrados en el aroma del fruto.  Los ésteres son los volátiles más numerosos. Mientras que el resto de los compuestos presentan concentraciones más bajas, las diferencias en estos compuestos demuestran cambios significativos en el aroma de la fruta (Yan et al., 2018).  Por tanto, la compleja composición de compuestos volátiles y no volátiles, junto con azúcares, ácidos orgánicos, compuestos fenólicos y taninos presentes son los que componen el sabor del fruto.

El interés por mejorar este aspecto organoléptico del fruto de fresa ha llevado a identificar genes relacionados con el control del aroma que, usados como marcadores moleculares asociados a dichos caracteres organolépticos, permita estudiar su comportamiento en diferentes poblaciones e identificar variedades con mejoras en el sabor o en el olor. Como ejemplo, asociado con la γ-decalactona, un volátil que otorga un ligero sabor a melocotón, se identificó una desaturasa de ácidos grasos, FaFAD1. Este gen está presente en variedades donde se ha identificado la γ-decalactona y ausente en aquellos que no la producen. (Chambers et al., 2014). De igual manera, la presencia de una metil trasferasa (FaOMT) es asociada al nivel de mesilfurano, un compuesto volátil que otorga notas de olor a cereza y que aparece en variedades que presentan esta enzima (Cruz-Rus et al., 2017).

Tabla 1. Compuestos más representativos que intervienen en el aroma del fruto de fresa

(Adaptado de Hancock, 1999).

Familia Química	Compuestos representativos
Ésteres de bajo peso molecular	Etil butanoato Etil hexanoato Hexil acetato Isoamil acetato
Cetonas	2-Heptanona 3-Hidroxibutanoato
Terpenoides	Linalool
	α-Terpineol
Furanonas	Furaneol
Dionas de bajo peso molecular	Diacetil
Derivados bencénicos Aldehídos insaturados Aldehídos saturados Alcoholes insaturados Ésteres insaturados Furaldehídos Ácidos grasos volátiles Ésteres tiólicos Varios	Benzaldehido t-2-Hexenal Hexanal t-2-Hexen-1-ol t-2-Hexenil acetato Furfural 2-Metiltiol acetato Metiltiol acetato Etil cinamato Naftaleno

La enzima alcohol-acil transferasa SAAT de fresa es específica del receptáculo del fruto y su expresión aumenta a lo largo de la maduración, cataliza los pasos finales de la síntesis de ésteres volátiles (Aharoni et al., 2000). SAAT cataliza la reacción usando como receptor preferente alcoholes alifáticos de cadena media, presentando actividades insignificantes con alcoholes aromáticos o monoterpenoles. Estudios posteriores han identificado otra AAT, denominada FaAAT2, con patrón de expresión génico relacionado con la maduración del fruto (Cumplido-Laso et al., 2012). FaAAT2 presenta actividad enzimática con alcoholes de diferentes tamaños (de 1 a 8 carbonos), y usando acetil-CoA como donante preferente. Se ha sugerido un papel fundamental de FaAAT2 en la producción de ésteres implicados en el aroma final del fruto (Cumplido-Laso et al., 2012).

Los ésteres producidos por las AAT son degradados por la acción de las carboxilesterasas (CXE). Las CXE comprenden una gran familia de enzimas hidrolíticas en plantas, que son miembros de la superfamilia de proteínas α/β hidrolasas. Estas enzimas degradan los ésteres para formar los correspondientes alcoholes y ácidos carboxílicos. En el grupo de investigación BIO-278 de la Universidad de Córdoba, hemos identificado una carboxilesterasa, FanCXE1, cuya expresión está relacionada con el proceso de maduración del fruto de fresa. Su caracterización enzimática determinó que, en ensayos in-vitro, FanCXE1 presenta mayor afinidad por ésteres de cadena larga. Además, el silenciamiento transitorio de esta enzima redujo el contenido de ésteres en el fruto, aumentando el de ciertos alcoholes (Martínez-Rivas et al., 2022).

La afinidad de FanCXE1 aumenta con el aumento de la longitud de la cadena del éster naftílico

Los análisis bioinformáticos mostraron que la proteína deducida del gen FanCXE1 contiene dominios funcionales bien conservados, como el dominio α/β hidrolasa y un dominio lipolítico GDXG. Esta secuencia también contiene una región transmembrana conservada. Estos datos nos proporcionaron evidencias de que la proteína codificada por el gen FanCXE1 podría tener actividad carboxilesterasa y que funcionaría ligada a la membrana celular. La producción de la proteína FanCXE1 recombinante en bacterias y su semipurificación ha permitido caracterizar su actividad carboxilesterasa. Así, FanCXE1 mostró mayor afinidad hacia los ésteres de naftilo de cadena más larga y, entre estos, el sustrato preferido fue el hexanoato de 2-naftilo. Esta actividad puede ser importante para la hidrólisis de ésteres de ácidos grasos de cadena durante la maduración.

FanCXE1 es un gen específico del receptáculo y las hormonas ácido abscísico (ABA) y auxinas regulan su expresión

El gen FanCXE1 mostró un patrón de expresión claramente relacionado con la maduración. Este gen se expresó predominantemente en receptáculo de frutos y en aquenios, y se expresó débilmente, o no se expresaba, en los tejidos vegetativos analizados. Este patrón de expresión es coincidente con los reportados previamente para otros genes relacionados con la maduración de la fresa, muchos de ellos relacionados con las propiedades organolépticas del fruto de la fresa (Cumplido-Laso et al., 2012; Medina-Puche et al., 2014-2015; Molina-Hidalgo et al., 2013- 2015-2017).

Se ha propuesto que la relación ABA/Auxinas es la responsable de desencadenar el proceso de maduración en la fresa (Medina-Puche et al., 2016). Por un lado, las auxinas, producidas por los aquenios, son liberadas al receptáculo de la fresa y son las responsables de los principales cambios que ocurren en el desarrollo temprano del fruto. Una vez que los frutos alcanzan el estadio blanco, se produce una disminución en la producción de auxinas, lo que desencadena el proceso de maduración. Por otro lado, los niveles de ABA aumentan gradualmente a lo largo de la maduración. Determinamos experimentalmente que FanCXE1 está regulado por ambas hormonas, con patrones de expresión paralelos a los que presentan otros genes relacionados con las propiedades organolépticas de la fresa.

FanCXE1 juega un papel importante en el catabolismo de ésteres volátiles en la fruta de fresa

Para investigar el papel de las CXE en fresa en la hidrólisis de ésteres y formación de compuestos volátiles producidos durante la maduración de la fruta de fresa, llevamos a cabo una disminución de la cantidad de transcrito mediante la técnica de silenciamiento por ARN interferente del gen FanCXE1. Los resultados obtenidos mostraron claras diferencias en el contenido de compuestos volátiles entre los frutos con la expresión de FanCXE1silenciada y los frutos control. De hecho, se encontró una mayor acumulación de ésteres en los frutos con la expresión del gen FanCXE1 silenciada y una menor concentración de compuestos alcohólicos, lo que revela que FanCXE1 juega un papel vital en su degradación. Además, no se observaron diferencias en la concentración de otros compuestos volátiles, lo que demuestra que la actividad de FanCXE1 es muy específica y restringida a algunos ésteres.

La actividad in vitro de FanCXE1 en la hidrólisis de ésteres, junto con el aumento de ésteres in vivo provocado por la disminución en la expresión de FanCXE1, indica que esta CXE es un regulador del contenido de ésteres volátiles en fresa.

Conclusiones

Las carboxilesterasas representan un grupo grande, diverso y complejo de enzimas con especificidades de sustrato superpuestas de las que se conoce poco acerca de sus sustratos naturales. En el fruto de la fresa, la expresión de FanCXE1, perteneciente a dicha familia, aumenta sustancialmente con la maduración del fruto y está regulada por ABA y auxinas, hormonas que controlan dicho proceso. Además, se ha comprobado que la enzima FanCXE1 es capaz de hidrolizar sustratos de ésteres artificiales que son similares a los producidos por el fruto de fresa maduro. Juntos, estos resultados sugieren que FanCXE1 tiene un papel importante en el metabolismo de los ésteres en el fruto maduro, modificando el perfil de ésteres producido por la fresa. Por tanto, los resultados de este trabajo sirven para mejorar la comprensión de la base molecular de las síntesis de volátiles en el fruto de fresa y así facilitar la generación de frutos con mejor sabor mediante la introducción de alelos relevantes en cultivares comunes.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por los proyectos AGL2014-55784-C2-2-R y AGL2017-86531-C2-2-R y del Ministerio de Ciencia e Innovación de España. El análisis de metabolitos fue realizado en el laboratorio del Dr. Alisdair Fernie, del Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas, en Postdam-Golm (Alemania).

REFERENCIAS

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Artículo publicado en la revista ECA FRUITS Ed. 19

Revista ECA FRUITS ED. 19